Elektroforezės metodo taikymas fermentinių preparatų grynumo nustatymui
5 (100%) 1 vote

Elektroforezės metodo taikymas fermentinių preparatų grynumo nustatymui

TURINYS

ĮVADAS………………………………………………………………………………………………………………………………….6

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI……………………………………………………………………………………..8

2. LITERATŪRINĖ DALIS………………………………………………………………………………………………………9

2.1. Baltymai……………………………………………………………………………………………………………………………9

2.2. Baltymų sudėtis ir struktūra…………………………………………………………………………………………………9

2.3. Amonio rūgščių seka baltymų molekulėse……………………………………………………………………………11

2.4. Erdvinė baltymų struktūra………………………………………………………………………………………………….14

2.5. Baltymų klasifikacija…………………………………………………………………………………………………………17

2.6. Baltymų savybės………………………………………………………………………………………………………………17

2.7. Rūgštinės – bazinės baltymų savybės………………………………………………………………………………….18

2.8. Baltymų biologinis vaidmo………………………………………………………………………………………………..19

2.9. Baltymų panaudojimas maistui ir pramonei………………………………………………………………………….20

2.10. Elektroforezė………………………………………………………………………………………………………………….21

2.11. Metodo pagrindai……………………………………………………………………………………………………………21

2.12. Elektroforezės sąlygos……………………………………………………………………………………………………..24

2.13. Aparatūra ir analizės atlikimas………………………………………………………………………………………….25

2.14. Nešikliai ir jų paruošimas…………………………………………………………………………………………………26

2.14.1. Popierius……………………………………………………………………………………………………………………..27

2.14.2. Celiuliozės acetatas………………………………………………………………………………………………………27

2.14.3. Plonieji nešiklio sluoksniai…………………………………………………………………………………………….27

2.14.4. Geliai………………………………………………………………………………………………………………………….27

2.15. Kiti elektroforezės metodai………………………………………………………………………………………………28

2.15.1. Elektroforezinė chromatografija…………………………………………………………………………………….28

2.15.2. Laipsninė elektroforezė…………………………………………………………………………………………………28

2.15.3. Aukštosios įtampos elektroforezė…………………………………………………………………………………..28

2.16. Metodo taikymas…………………………………………………………………………………………………………….29

3. EKSPERIMENTINĖ DALIS………………………………………………………………………………………………..30

3.1. Elektroforezės metodika…………………………………………………………………………………………………….30

3.1.1. Tirpalų ruošimas…………………………………………………………………………………………………………….30

3.1.2. Dažai…………………………………………………………………………………………………………………………….31

3.1.3. Elektroforezės atlikimas………………………………………………………………………………………………….31

3.1.4. Rezultatų apibendrinimas………………………………………………………………………………………………..35

4. EKONOMINIŲ SKAIČIAVIMŲ DALIS………………………………………………………………………………37

4.1. Ilgalaikių investicijų apskaičiavimas…………………………………………………………………………………..37

4.2. Medžiagų ir energetinių išteklių vertės apskaičiavimas………………………………………………………….38

4.2.1. Medžiagų vertė………………………………………………………………………………………………………………38

4.2.2. Vandens kiekis ir vertė……………………………………………………………………………………………………38

4.2.3. Elektros energijos kiekis ir
vertė………………………………………………………………………………………39

4.3. Darbo užmokesčio apskaičiavimas……………………………………………………………………………………..40

4.4. Išlaidų apskaičiavimas……………………………………………………………………………………………………….40

4.4.1. Išlaidų struktūros apskaičiavimas……………………………………………………………………………………..41

4.5. Kainos apskaičiavimas………………………………………………………………………………………………………41

Kaštų struktūra……………………………………………………………………………………………………………………….42

5. ŽMOGAUS IR GAMTOS SAUGA………………………………………………………………………………………43

5.2. Darbų saugos instrukcija dirbančiajam laboratorijoje…………………………………………………………….43

5.2.1. Bendroji dalis………………………………………………………………………………………………………………..43

5.2.2. Reikalavimai keliami laboratorijoje………………………………………………………………………………….44

5.2.3. Darbuotojų veiksmai preiš darbo pradžią…………………………………………………………………………..45

5.2.4. Darbuotojo veiksmai darbo metu……………………………………………………………………………………..45

5.2.5. Cheminių medžiagų neutralizavimas………………………………………………………………………………..46

5.2.6. Darbuotojo veiksmai baigus darbą……………………………………………………………………………………48

6. IŠVADOS…………………………………………………………………………………………………………………………..49

LITERATŪRA……………………………………………………………………………………………………………………….50

ĮVADAS

Biochemijos institutas Lietuvos Mokslų akademijos (LMA) Prezidiumo 1966 11 23d. nutarimu Nr 470 įsteigtas nuo 1967m. sausio 1d. Šiuo nutarimu nustatytos tokios pagrindinės Institute vykdomų mokslinių tyrimų kryptys: “fermentų struktūros ir modeliavimo tyrimai; dirbtinių biokatalizatarių ir mutageninių mikroorganizmų formas, produkuojančias tam tikrus fermentus ir gyvulininkystei naudingą biomasę; citotoksinių cheminių medžiagų sintezė ir jų poveikio ląstelės gyvybingumui tyrimai; baltymų deficitinių aminorūgščių ir vitaminų iš maistinių ir techninių žaliavų atliekų sintezės, cheminių mikrobiologinių procesų tyrimai”.

Šiuo metu Instituto mokslinės veiklos kryptys yra tokios:

1. Genų struktūros ir ekspresijos reguliavimo tyrimai

2. Ekoriotinės ląstelės funkcinių sistemų veikimo ir reguliavimo tyrimai

3. Biologinių katalizatorių struktūros, funkcionavimo ir praktinio naudojimotyrimai

4. Bioorganinių junginių sintezė, jų savybių ir pritaikymo tyrimai

Visos eilės Instituto mokslininkų tarptautinis pripažinimas sudarė prielaidas plačiam bendradarbiavimui su Vakarų šalių partneriais, kuris ypatingai suaktyvėjo po Lietuvos nepriklausomybės atkūrimo. Bendrus mokslinius tyrimus Instituto darbuotojai atlieka kartu su JAV, Švedijos, Prancūzijos, Vokietijos, Danijos, Ispanijos, Anglijos, Airijos, Olandijos, Belgijos, Norvegijos universitetais ir kitais moksliniais centrais. Dėka šių tarptautinių ryšių Biochemijos institutas tapo daugelio bendrų mokslinių projektų vykdytoju. Instituto mokslo darbuotojai nuo 1992m. nuolatos vykdo ir didelių užsienio kompanijų užsakytus mokslinius tyrimus. Pastaruoju metu tokiais užsakovais buvo Danijos biotechnologinė kompanija “Novo Nordisk A/S”, Japonijos chemijos ir elektroninių-medicininių prietaisų kompanija “Cheeso” bei cheninių reagentų gamybos firmos “Aldrich” Vokietijos filialas.

Dėka glaudos bendradarbiavimo su daugeliu Lietuvos mokslo ir studijų institucijų, Biochemijos institutui suteikta teisė teikti biologijos ir chemijos krypčių daktaro mokslo laipsnius.

Svarbiu Instituto istorijos etapu buvo naujo Instituto pastato statyba. Greta pagrindinio skyriaus korpuso taip pat buvo pastatytos atskiros eksperimentinės gamybinės bazės ir vivariumo patalpos. Dabar šiose patalpose yra įsikūrę dešimt pagrindinių Instituto padalinių:

1. Bioanalizės skyrius.

Darbo kryptis: biosensorių kūrimas, naujų bioanalitinių sistemų konstratavimas ir elektronų pernašos tyrimas sistemoje: fermentas – elektrodas.

2. Bioelektrochemijos ir biospektroskopijos skyrius.

Darbo kryptis: struktūrinės funkcinės organizacijos bei elektrocheminių ir bioatpažinimo procesų tyrimai biomembranų sistemose ir jų modeliuose.

3. Bioorganinių junginių chemijos skyrius.

Darbo kryptis: bioorganinių junginių kaip biologinių procesų modeliatorių sintezės metodų paieška, sintezė ir savybių tyrimas. Įvairios paskirties organinių medžiagų resintezė, gausinimas, technologinių sąlygų kūrimas.

4. Fermentų chemijos skyrius.

Darbo
fermentų struktūros ir funkcijų tyrimas, fermentinės elektrono pernešimo reakcijos, biojutiklių (biosensorių) konstravimas ir jų veikimo analizė.

5. Genų inžinerijos skyrius.

Darbo kryptis: mikroorganizmų genų struktūros, funkcijos ir veiklos reguliavimo tyrimai.

6. Ksenobiotikų biochemijos skyrius.

Darbo kryptis: redoksaktyvių ksenobiotikų sintezė ir tyrimai.

7. Molekulinės mikrobiologijos ir biotechnologijos skyrius.

Darbo kryptys: fermentų biotechnologija nuo mikroorganizmų atrankos, baltymų gryninimo, genų klonavimo ir modifikavimo iki rekombinantinių baltymų tyrimo, modeliavimo ir panaudojimo.

Arenų ir heterociklių mikrobinės degradacijos bioįvairovės tyrimas.

Fermentų, skirtų analitikai, produkcija.

8. Vystymosi biologijos skyrius.

Darbo kryptis: ląstelės augimo, diferenciacijos ir žūties (apoptozės) tyrimas.

9. Patentinės analizės ir informacijos skyrius

Darbo kryptis: teikia techninės informacijos paslaugas.

10. Vivariumas

Darbo kryptis: kancerogenezės mechanizmų tyrimas.

Aš atlikau savo diplominį darbą molekulinės mikrobiologijos ir biotechnologijos skyriuje. Šiame skyriuje dirba 7 darbuotojai: 3 mokslo darbuotojai, viena jaunesnioji mokslo darbuotoja ir kiti techninis personalas.

Šis skyrius tiria mikrobų įvairovę, taip pat kokiomis savybėmis jie pasižymi, klonuoja genus ir juos tiria (didį, sudėtį, DNR), elektroforezės metodu nustato baltymų grynumą, švarumą.

Viena iš panaudojimo sričių yra biosensorių kūrimas.

1. DARBO TIKSLAS IR UŽDAVINIAI

Diplominio darbo tikslas – susipažinti su baltymų frakcionavimu ir pritaikyti juos fermentinių preparatų analizei.

Diplominio darbo uždaviniai:

• susipažinti su Instituto veikla;

• surinkti literatūrą apie baltymų savybes ir struktūrą;

• surinkti literatūrą apie elektroforezės metodus;

susipažinti su elektroforezės metodų panaudojimu, baltymų frakcionavimui;

• pritaikyti elektroforezės metodus fermentinių preparatų grynumo bei išgrynintų baltymų molekulinės masės nustatymui.

2. LITERATŪRINĖ DALIS

2.1. Baltymai

Stambiamolekuliniai junginiai, sudaryti iš aminorūgščių likučių, vadinami baltyminėmis medžiagomis – baltymais. Nėra nė vieno gyvo organizmo, augalo ar gyvūno, kuriame baltymai neatliktų gyvybiškai svarbių funkcijų. Visur, kur yra gyvybė, yra ir baltyminės medžiagos.

Baltymų išorinė išvaizda, jų fizinė būklė gali būti labai įvairi, kaip ir pačios funkcijos, kurias jie atlieka organizme. Kiaušinio, raumenų, skeleto ir sąnarių, odos, plaukų, ragų, kanopų baltymai – visa tai skirtingos baltymų rūšys. Kraujuje yra ištirpusi grupė baltymų, iš jų ir baltymas hemoglobinas, pernešantis deguonį. Piene yra baltymo kazeino ir didelė grupė kitų baltymų. Įvairiausi fermentai – medžiagų apykaitos gyvuosiuose organizmuose katalizatoriai – visi be išimties priskiriami baltyminėms medžiagoms.

Augaluose baltymai, taip sakant, neatlieka “struktūrinių funkcijų”; augalinės ląstelės skeletą sudaro polisacharidas celiuliozė. Tačiau ir augaluose baltymai atlieka ne mažiau svarbias gyvybines funkcijas, susikaupdami daugiausia sėklose.

Kai kurie baltymai atlieka apsaugines funkcijas. Iš jų sudaryti nagai, ragai, kanopos, plaukai, vilna ir t.t.

Labai svarbi baltymų funkcija siejama su medžiagų apykaitos, arba metabolizmo, reiškiniais. Atlikdami įvairias funkcijas organizme, baltymai kinta. Nuolatinis jų molekulių skilimas ir atsinaujinimas sudaro gyvybinių procesų esmę. Visus tokius kitimus katalizuoja vėl baltymai, vadinamieji fermentai arba enzimai. Be fermentų, organizmo gyvybines funkcijas reguliuoja vidaus sekrecijos liaukų produktai – hormonai. Dalis jų taip pat baltyminės medžiagos

2.2. Baltymų sudėtis ir struktūra

Beveik į visų baltymų sudėtį įeina penki elementai: anglis, vandenilis, deguonis, azotas ir siera (kai kuriuose esti ir fosforo).

Šių elementų kiekis svyruoja tokiose ribose:

Anglis 50-55%

Vandenilis 6.5-7.3%

Azotas 15-18%

Deguonis 21.5-23.5%

Siera 0.3-2.5%

Baltymų molekulinė masė svyruoja nuo kelių tūkstančių iki kelių milijonų, t.y. aminorūgščių likučių baltymų molekulėje esti nuo kelių dešimčių iki šimtų tūkstančių. Pavyzdžiui, gamtinis polipeptidas oksitocinas – hormonas, kurį išskiria užpakalinė hipofizio dalis, – sudarytas iš 9 aminorūgščių, jo molekulinė masė 1007; adrenokortikotropinio hormono (23 aminorūgštys) molekulinė masė 3200; fermento ribonukleazės (124 aminorūgštys) molekulinė masė 15000; hemoglobino (kraujo baltymo) molekulinė masė 68000, o virusų baltymų molekulinė masė gali būti net 50 milijonų.

Jau vien šios molekulinės masės rodo baltymų įvairovę. Tačiau svarbiausia baltymų įvairumo priežastis, lyginant juos pavyzdžiui su polisacharidais, yra ta, kad į baltymų molekulės sudėtį gali įeiti apie 20 įvairių aminorūgščių, kai paprasti polisacharidai (celiuliozė, krakmolas) esti sudaryti iš vieno monosacharido – gliukozės.

Nuo aminorūgščių sudėties ir jų jungčių tvarkos baltymo molekulėje priklauso pirminė baltymo struktūra. Pavyzdžiui, vieno iš baltyminių hormonų –
pirminė struktūra išreiškiama šia schema:

NH2 NH2

Cys – Tyr – Ileu – Glu – Asp – Cys – Pro – Leu – Gly – NH2

S S

1 pav. Oksicino pirminė struktūra

kur: Cys – Cisteinas

Tyr – Tirozinas

Ileu – Izoleucinas

Glu – Glutamino rūgštis

Asp – Asparagino rūgštis

Pro – Prolinas

Leu – Leucinas

Gly – Glicinas (glikokolis)

Natūralioje būklėje esančių baltymų savybės priklauso ne tik nuo pirminės struktūros – labai svarbią reikšmę turi baltymų molekulių erdvinė forma. Polipeptidinė grandinė gali būti įvairiausios konformacijos, pavyzdžiui, α – spiralės forma. Polipeptidinės grandinės konformacinės savybės lemia antrinę baltymo struktūrą.

Tam tikros antrinės struktūros grandinė gali, susiklostydama erdvėje, sudaryti tretinę struktūrą.

Veikiami šilumos, cheminių reagentų, baltymai praranda savo natūralias savybes net jeigu ir nevyksta jokie cheminiai pakitimai. Toks procesas vadinamas denatūracija. Jis susijęs su antrinės ir tretinės struktūros pakitimais [7].

2.3. Amino rūgščių seka baltymų molekulėse (pirminė struktūra)

Sintetiniams ir daugeliui gamtinių polimerų būdingas polidispersiškumas. Jų molekulės būna įvairaus ilgio. Eksperimentiškai nustatomas polimerinės grandinės ilgis arba molekulinė masė yra vidutiniai dydžiai. Baltymai – visiška priešingybė. Visos to paties baltymo molekulės yra identiškos, turi tą patį polipeptidinės grandinės ilgį ir tą pačią cheminę struktūrą. Todėl vienas iš baltymų tyrimo uždavinių yra nustatyti polipeptidinėje grandinėje aminorūgščių seką, vadinamą pirmine baltymų struktūra. Pirmasis baltymas, kuriam tai buvo padaryta, – insulinas, polipeptidinės prigimties hormonas, sintetinamas kasos liaukoje ir reguliuojantis cukrų apykaitą. Jei žmogaus organizmas nepagamina insulino, susergama liga, vadinama diabetu, arba cukralige.

Insulino molekulė susideda iš dviejų polipeptidinių grandinių žymimų raidėmis A ir B, sujungtų dviem disulfidiniais tilteliais. Sutrumpintu aminorūgščių žymėjimu insulino pirminę struktūrą galima užrašyti šitaip:

S S

Gly – Ile – Val – Glu – Glu – Cys – Cys – Ala – Ser – Val – Cys – Ser – Leu – Tyr – Glu – Leu – Tyr – Asn – Tyr – Cys –Asn

1 5 S 10 15 S 20

A

S S

Phe – Val – Asn – Glu – His – Leu – Cys – Gly – Ser – His – Leu – Val – Glu – Ala – Leu – Tyr – Leu – Val – Cys – Gly – Glu – Arg – Gly – Phe

1 5 10 15 20 Phe

25

B Ala – Lys – Pro – Thr – Tyr

30

2 pav. Jaučio insulino pirminė struktūra

Susitarta užrašant polipeptido pirminę struktūrą pradėti nuo N – galo ir užbaigti C – galu. N – galinė aminorūgšties liekana žymima pirmu numeriu, kaip parodyta schemoje insulino atveju.

Kaip matome pateiktoje struktūroje, grandinėje A yra 21, o grandinėje B – 30 aminorūgščių. Taigi jaučio insulinas – labai nedidelis baltymas, jo molekulinė masė nesiekia 6000.

Tuo tarpu žmogaus insulinas, kurio aminorūgščių seka ištirta kiek vėliau, skiriasi nuo jaučio insulino tuo, kad trys aminorūgštys pakeistos kitomis:

A grandinė B grandinė

8 9 10 29 30

Jaučio insulinas – Ala – Ser – Val – – Lys – Ala –

Žmogaus insulinas – Thr – Ser – Ile – – Lys – Thr –

Insulino pirminės struktūros nustatymas buvo nepaprastai svarbus biochemijos raidos žingsnis. Pirmą kartą buvo neginčijamai įrodyta, kad visos to paties baltymo molekulės yra vienodos. Dar neužbaigus insulino tyrimo buvo pradėta šifruoti kelių kitų baltymų aminorūgščių sekas. 1960 – 1961 m.
trijų baltymų pirminės struktūros. Visuose trijuose baltymuose rasta tik po vieną peptidinę grandinę. Jos ilgis stambiausiame (tabako mozaikos baltyme) – 158 aminorūgščių liekanos. 1963 m. pabaigoje jau buvo žinoma 14 baltymų pirminė struktūra.

Pirminių struktūrų tyrimai svarbūs medicinai. Žinoma nemaža įgimtų ligų, kurių priežastis – vienos ar kelių aminorūgščių pakeitimas konkretaus baltymo peptidinėje grandinėje. Tokių ligų atskleidimu ir diagnoze užsiima nauja medicinos šaka – molekulinė patologija.

Labai svarbų vaidmenį baltymų pirminės struktūros tyrimuose turėjo ir dabar turi N- galinių aminorūgščių liekanų identifikavimas. F. Sendžeris pasiūlė šiam tikslui N – galinių aminorūgščių cheminio žymėjimo metodą. Tai galima pailiustruoti heksapeptido pavyzdžiu. Šarminiame tirpale peptidas veikiamas 2,4-dinitrofluorbenzenu. Galinė aminogrupė, taip pat lizino liekanos aminogrupė sąveikauja su reagentu ir virsta 2,4-dinitrofenildariniais. Modifikuotas peptidas rūgštine hidrolize suardomas iki laisvųjų aminorūgščių. Dinitrofenilo grupė hidrolizės metu neatskyla, todėl N – galinė aminorūgštis ir lizinas lieka pažymėti:

OH¯

O2N F + Ala – Asp – Lys – Gly – Val – Gly

NO2

NO2 NH – CH – CONH – CH – CONH –

NO2 CH3 CH2COO¯

– CH – CONH – CH2 – CONH – CH – CONH – CH2 – COO¯

CH(CH3)2

(CH2)4–NH NO2

20% HCl

NO2 NH – CH – COOH + NH3 – CH – COOH +

CH3 CH2COOH

NO2

+ NH3 – CH – COOH + NH3 – CH2 – COOH +

(CH2)4 – NH NO2

NO2

+ NH3 – CH – COOH + NH3 – CH2 – COOH

CH (CH3)2

3 pav. Dinitrofenilo grupės hidrolizė.

Ekstrahuojant hidrolizės mišinį organiniais tirpikliais, pvz., eteriu, išsiekstrahuoja tik pažymėtoji N – galinė aminorūgštis; visos kitos lieka vandens sluoksnyje.Taip įvyksta todėl, kad stipriai atitraukiant elektronus dinitrofenilo grupė labai sumažina amininio azoto bazingumą (pKa<<0). Net ir stipriai rūgščiame tirpale modifikuotoji N – galinė aminorūgštis yra neutralios jonizacinės formos, todėl tirpsta organiniuose tirpikliuose. Visų kitų aminorūgščių α – aminogrupės visiškai protonizuotos, kaip parodyta reakcijos schemoje, todėl jos organiniuose tirpikliuose netirpsta. Išekstrahuotą žymėtąją N – galinę aminorūgštį nesunku identifikuoti chromatografiniu ar kitu būdu. Dinitrofenilamino grupė suteikia žymėtajai aminorūgščiai geltoną spalvą. Chromatogramose be jokių ryškinančių reagentų matoma geltona dėmelė.

Vėliau buvo pasiūlyta ir kitokių reagentų N – galinei aminorūgščiai pažymėti. Populiariausias iš jų yra dabsilo chloridas. Juo pažymėtos aminorūgšties spalva ryškesnė ir intensyvesnė negu naudojant 2,4-dinitrofluorbenzeną, todėl metodas yra jautresnis.

(CH3)2N N N SO2Cl

4 pav. Dabsilo chloridas

N – ir C – galines aminorūgštis galima identifikuoti fermentiniais metodais. Yra fermentų, kurie atskelia po vieną aminorūgštį nuo peptidinės grandinės N – galo (aminopeptidazės) arba nuo C – galo (karboksipeptidazės). Stebint laisvųjų aminorūgščių koncentracijų didėjimą fermentinės reakcijos mišinyje, atspėjama po 2 – 3 galines aminorūgštis.

Didžiulės daugumos baltymų polipeptidinės grandinės kur kas ilgesnės negu 50 aminorūgščių liekanų. Tiriant pirminę struktūrą, tenka pirmiausia juos suskaidyti į stambius peptidus, kurių kiekvienas tiriamas atskirai. Yra cheminių ir fermentinių metodų peptidinei grandinei specifiškai (norimose vietose) nutraukti. Pavyzdžiui, fermentas tripsinas katalizuoja baltymų hidrolizę ties lizino ir arginino karboksilinėmis grupėmis. Heksapeptidą tripsinas suardo į du tripeptidus:

H2O, tripsinas

Ala – Asp – Lys – Gly – Val – Gly Ala – Asp – Lys + – Gly – Val – Gly

5 pav. Heksapeptido suardimas

Suskaidžius baltymą 2 – 3 būdais ir suradus aminorūgščių sekas gautuose peptiduose, paprastai pavyksta vienareikšmiškai nustatyti baltymo pirminę struktūrą. Bet stambių baltymų, turinčių polipeptidinėje grandinėje 500 – 1000 ir daugiau aminorūgščių liekanų, pirminę struktūrą ištirti yra labai sudėtinga.

Buvo atrastas iš principo naujas baltymų pirminės struktūros tyrimo metodas,
kuris papildo aukščiau aprašytus tiesioginius metodus. Yra žinoma, kad baltymų pirminė struktūra yra užkoduota gyvųjų organizmų genuose, nukleino rūgščių sudėtyje esančių purino ir pirimidino bazių sekose. Dabartiniu metu jau mokama gana lengvai nustatyti šių bazių sekas ir tokiu būdu numatyti koduojamų baltymų pirmines struktūras [2].

2.4. Erdvinė baltymų struktūra

Paprastumo galima naudoti įprastą molekulių tūriniams modeliams mastelį (1 Å = 1 cm), vidutinio stambumo baltymo, turinčio 300 aminorūgščių liekanų, ištempto konformero modelis būtų apie 10 m ilgio. Gamtinėmis sąlygomis (vandens terpė, neaukšta temperatūra ir t. t.) baltymų molekulės nebūna ištemptos ar tik šiek tiek susivijusios, o susilanksto į kompaktišką, artimą rutulio formai kamuolėlį, vadinama globula. Baltymui, turinčiam 300 aminorūgščių liekanų, globulos skersmuo yra apie 50 Å, kitaip sakant, jo molekulinį modelį – 10 m ilgio kaspiną turime sulankstyti į 50 cm skersmens kamuolį.

Anglų mokslininkai 1935 m. padarė pirmąsias baltymų kristalų rentgenogramas. Gautas difrakcinis vaizdas rodė, kad globulos yra vienodos. Šie eksperimentai paskatino tirti erdvinę baltymų struktūrą.

Spėjamos struktūros leidžia susidaryti maksimaliam vandenilinių ryšių skaičiui tarp peptidinės grandinės – CO – ir – NH – grupių. Abi šios grupės yra hidrofilinės, t. y., linkusios būti supamos vandens molekulių. Dalyvavimas vandeniliniuose ryšiuose kompensuoja solvataciją, todėl α – spiralės ir β – struktūros (5, 6 pav.) gali egzistuoti hidrofobiškoje baltymo globulos vidaus aplinkoje. Vandeniliniai ryšiai yra pagrindinis veiksnys, lemiantis peptidinių grandinių erdvinį išsidėstymą. α – Spiralės matmenys tokie, kad virš peptidinio ryšio deguonies atomo stovi ketvirtos iš eilės aminorūgšties – NH – grupė. Tarp deguonies ir vandenilio atomų susidaro vandenilinis ryšys. Vienos spiralės ilgis – 5,4 Å, joje telpa 3,6 aminorūgščių liekanų.

A B

6 pav. α – Spiralinė peptidinės grandinės struktūra

7 pav. β – Struktūra

Malonu pastebėti, kad 1995 m. paskelbta erdvinė struktūra pirmojo baltymo, kurį tiriant pagrindinį vaidmenį atliko Lietuvos mokslininkai. Ištirtasis baltymas – nukleino rūgštis specifiškai hidrolizuojantis fermentas restriktazė Cfr 10I buvo išgrynintas ir iškristalizuotas Vilniuje, Biotechnologijos institute, rentgenostruktūriniai tyrimai atlikti kartu su Vokietijos specialistais. Šio baltymo pavyzdžiu galima susipažinti su baltymų erdvinės struktūros žymėjimu ir bendrais principais. 7 paveiksle, A ir B, parodyti restriktazės Cfr 10 I globulos tūriniai modeliai, paryškinant hidrofilines ir hidrofobines aminorūgščių šonines grupes. Aiškiai matyti, kad hidrofobinės šoninės grupės susirinkusios globulos viduje, be to, jos supakuotos labai kompaktiškai, nepaliekant tuščios vietos. Globulos viduje paprastai nebūna vandens molekulių. Hidrofobinės šoninės grupės susirinkusios globulos viduje, be to, jos supakuotos labai kompaktiškai, nepaliekant tuščios vietos. Globulos viduje paprastai nebūna vandens molekulių. Hidrofilinės šoninės grupės daugiausia yra globulos paviršiuje. Taip yra todėl, nes tokia erdvinė struktūra termodinamiškai naudingiausia vandens tirpale. Būtent evoliucijos eigoje per atsitiktines mutacijas susikūrė pirminės baltymų struktūros, kad pasidarė galimas būtent toks susilankstymas į globulas.

A B

8 pav. Restriktazės Cfr 10 I tūriniai modeliai: A – baltymo globulos vidus (pjūvis), B – baltymo globulos išorė.

Paprasčiausi erdvinės struktūros elementai (α – spiralės, β – struktūros, vingiai) vadinami antrine baltymų struktūra. Visas peptidinės grandinės ir šoninių grupių išsidėstymas erdvėje vadinamas tretine struktūra. Tretinė baltymo struktūra – tai visa jo globulos erdvinė struktūra, kurią gauname iš rentgenostruktūrinės analizės. Pastaraisiais metais išmokta rasti nedidelių baltymų tretines struktūras iš BMR spektroskopijos duomenų. Tai yra svarbu, nes tyrimas atliekamas tirpale, nereikia gauti baltymo kristalo. Daugelio baltymų nepavyksta iškristalizuoti.

Kai kurių baltymų pavyzdžiu įrodyta, kad būdinga jiems tretinė struktūra susidaro savaime, ji yra termodinamiškai stabiliausias baltymo konformeras. Būtent, tretinę baltymo struktūrą nulemia pirminė struktūra. Mokslininkai deda daug pastangų išmokti teoriškai numatyti, kokia bus baltymo tretinė struktūra, jei žinoma pirminė. Bet pasiekimai dar labai kuklūs.

Pastaraisiais metais įrodyta, kad savaime susidaro tik paprastesniųjų, nedidelės molekulinės masės baltymų tretinė struktūra. Ląstelėse egzistuoja specialūs baltymai, vadinami čaperonais, kurie padeda teisingai susivynioti į globulas sudėtingesniesiems baltymams.

Daugelio baltymų globulos linkusios jungtis į stambesnius asociatus, sudarytus iš 2,3 ir daugiau narių. Tokie asociatai vadinami ketvirtine baltymų struktūra, o įeinančios į jų sudėtį baltymo globulos – subvienetais. Ketvirtinė struktūra gali būti sudaryta iš vienodų arba iš skirtingų subvienetų. Pavyzdžiui,
auglių nekrozės faktorius yra trimeras, sudarytas iš vienodų subvienetų; hemoglobinas –tetrameras, sudarytas iš dviejų porų skirtingų subvienetų. Ketvirtinė struktūra dažniausiai labai labili, nes subvienetų neriša kovalentiniai ryšiai, o tik tarpmolekulinės sąveikos jėgos [2].

2.5. Baltymų klasifikacija

Baltymai, kuriems hidrolizuojantis susidaro vien tik aminorūgštys, vadinami proteinais. Atsižvelgiant į savybes ir biologines funkcijas, baltymai biochemijoje skirstomi į daugelį grupių (pavyzdžiui, albuminai, globulinai, protaminai, glutelinai).

Sudėtiniai baltymai, arba proteidai, yra baltymų ir nebaltyminės dalies junginys. Atsižvelgiant į nebaltyminės dalies tipą, skiriami šių grupių proteidai:

1. Fosfoproteidai

2. Lipoproteidai

3. Glikoproteidai

4. Nukleoproteidai

5. Chromoproteidai

2.6. Baltymų savybės

Baltymų molekulės turi laisvas karboksilo ir amino grupes. Priklausomai nuo tų grupių santykio, molekulė turi teigiamą arba neigiamą krūvį, kuris taip pat priklauso ir nuo terpės pH. Rūgščioje terpėje baltymų molekulė įsielektrina teigiamai, nes jonizojasi aminogrupė, o šarminėje – neigiamai, nes disocijuoja karboksilas. Kiekvienam baltymui būdinga tokia pH reikšmė, kai jo teigiami krūviai kompensuoja neigiamus. Tai baltymų izoelektrinis taškas. Daugumos baltymų izoelektriniai taškai mažesni už pH = 7.

Baltymų tirpumas labai nevienodas: vieni jų tirpsta vandenyje, kiti – tam tikros koncentracijos druskų tirpaluose, treti vandeniniuose – alkoholiniuose tirpaluose. Yra ir visiškai netirpių.

Baltymų nusodinimas druskomis vadinamas išsūdymu. Druskų jonams atėmus hidratuotą vandenį, baltymų molekulės sukimba į didesnius agregatus, kurie ir iškrenta nuosėdomis. Dažniausiai baltymai išsūdomi amonio sulfatu.

Gryniems baltymams gauti reikia pašalinti druskų priemaišas. Tai atliekama dializuojant baltymų tirpalą. Sparčiau už dializę druskos pašalinamos, praleidžiant baltymų tirpalą pro kolonėlę su sefadeksu. Iš kolonėlės išteka grynas baltymų tirpalas, o jonai susilaiko kolonėlėje.

Be lengvųjų metalų druskų, baltymus grįžtamai nusodina organiniai tirpikliai: etanolis, acetonas, eteris.

Vario, gyvsidabrio, švino ir kitų sunkiųjų metalų druskos sudaro kompleksus su SH bei kitomis grupėmis, todėl jau nedideli tų druskų kiekiai baltymus nusodina. Kartais tokius nusodintus baltymus vėl galima ištirpinti, bet dažniausiai jie nusėda negrįžtamai. Šis reiškinys vadinamas baltymų denatūracija.

Denatūruojami baltymai netenka daugelio savybių, visų pirma biologinio aktyvumo. Šiuo atžvilgiu jie yra labai jautrios medžiagos.

Baltymai denatūruojasi, net paprastoje temperatūroje koncentruojant jų tirpalus, todėl siekiant išvengti denatūracijos, baltymų tirpalai koncentruojami veikiant sefadeksu, kuris sugeria vandenį. Kietos formos baltymus patogiausia gauti liofilizacijos būdu. Tam tikslui baltymų tirpalas užšaldomas vakuume, vanduo iš lėto sublimuojasi, ir gaunamas miltelių pavidalo preparatas, kuris tinkamomis sąlygomis ilgą laiką išlieka nepasikeitęs.

Svarbus baltyminių medžiagų požymis – spalvinės reakcijos. Iš jų sprendžiama, kokios atomų grupės yra baltymų molekulėje. Pavyzdžiui, virinami su azoto rūgštimi, baltymai nusidažo geltonai (ksantoproteino reakcija). Tai rodo, kad baltymų molekulėje yra aromatinis žiedas. Šildomi su sidabro nitrato tirpalu azoto rūgštyje, kurioje esama nedaug nitritinės rūgšties (Milono reagentu), baltymai nusidažo raudonai. Tai rodo, kad jų molekulėje yra fenolio likutis. Tokių spalvinių reakcijų žinoma ir daugiau [1].

2.7. Rūgštinės – bazinės baltymų savybės

Žinoma, kad iš baltymuose esančių 20 aminorūgščių septynių šoninės grupės gali jonizuotis. Kartu su galinėmis amino- ir karboksiline grupėmis jos suteikia baltymo globulai elektrinį krūvį, kurio ženklas ir dydis priklauso nuo tirpalo pH. Kiekvienam baltymui egzistuoja pH reikšmė, kuriai esant globulos elektrinis krūvis lygus nuliui. Šis pH vadinamas baltymo izoelektriniu tašku ir žymimas pI, lygiai taip pat, kaip aminorūgštims. Kai pHpI, neigiama. Suprantama, kad pI<7 tų baltymų, kuriuose vyrauja aminorūgštys, turinčios rūgštines šonines grupes (aspargo ir glutamo rūgštys). Ir atvirkščiai, pI>7 yra tų baltymų, kuriuose daugiau bazinių aminorūgščių – lizino, arginino. Pavyzdžiui, insulino pI = 4,8.

Baltymo izoelektrinis taškas yra labai svarbi konstanta. Kai pH = pI, baltymo tirpumas yra minimalus, jis linkęs koaguliuoti – sudaryti nuosėdas. Norint baltymą nusodinti, tikslinga daryti pH artimą pI. Kai norim baltymą ištirpinti, pH geriau parinkti pakankamai skirtingą nuo pI.

Globulos elektriniu krūviu pagrįsti svarbiausi baltymų atskyrimo ir gryninimo metodai -elektroforezė ir jonų mainų chromatografija. Esant pHpI ir globula neigiama, baltymas juda link teigiamo elektrodo, sorbuojasi ant anijoninių sorbentų.

2.8. Baltymų biologinis vaidmuo

Ira žinoma daug baltymų, kurie yra biokatalizatoriai. Tai svarbiausias jų biologinis vaidmuo. Kiekvienoje gyvoje ląstelėje vyksta tūkstančiai cheminių reakcijų, ir tik nedaugelis
nekatalitinės. Baltymai, kurie katalizuoja biocheminius procesus, vadinami fermentais, arba enzimais. Fermentai yra labai specifiški katalizatoriai, jie paprastai pagreitina tik vieną reakciją. Galima teigti, kad kiekvienai biocheminei reakcijai, tiksliau, kiekvienai jos stadijai egzistuoja atskiras fermentas.

Fermentų tyrimais užsiima biochemijos mokslo šaka enzimologija. Medžiagos, kurių pakitimus fermentas katalizuoja, vadinamos substratais. Fermento pavadinimas paprastai sudaromas prie substrato pavadinimo pridedant galūnę –azė. Dažnai dar į pavadinimą įterpiamas žodžio fragmentas, nurodantis reakcijos tipą.

Pagal katalitinio veikimo efektivumą ir specifiškumą fermentai toli lenkia cheminėje pramonėje naudojamus neorganinius katalizatorius, todėl fermentinės reakcijos pakankamai greitai vyksta fiziologinėmis sąlygomis – vandens tirpale 20 – 40° temperatūroje. Tipiškas reakcijos pagreitėjimas dėl fermentinės katalizės yra 10 – 10 kartų, palyginti su nekatalitine reakcija. Fermentas stabilizuoja reakcijos tarpinę būseną labiau negu pradines medžiagas, todėl sumažėja aktyvacijos energija, ir reakcija pagreitėja.

Fermentų specifiška savybė – atpažinti “savuosius” substratus, nesupainioti jų su panašiomis molekulėmis, glaudžiai susijęs su baltymų erdvine struktūra. Kiekvienas fermentas turi aktyvų centrą, tą globulos paviršiaus dalį, kurioje vyksta katalitinis procesas. Aktyvaus centro erdvinė struktūra atitinka substrato struktūrą, panašiai kaip spyna atitinka raktą. Greta grynai erdvinio atitikimo, matyt, labai svarbus elektroninės struktūros atitikimas: ant kontaktuojančių fermento ir substrato paviršių išsidėstę elektriniai krūviai, elektronodonorines savybes turinčios grupės.

Yra baltymų, kurie transformuoja gyvybei reikalingą energiją ir ją perduoda. Jie maistą paverčia šiluma, chemine ir mechanine energija. Raumenų darbą irgi atlieka baltymai. Ši baltymų funkcija savais mechanizmais artima jų katalitinei, fermentinei funkcijai. Daugeliu atvejų abi šios funkcijos sutampa.

Kiti baltymai atlieka apsaugines, atramines funkcijas, įeidami į ląstelių sienelių, apsauginių audinių, kaulų sudėtį. Pagrindinis odos komponentas yra baltymas kolagenas, plaukų – baltymas keratinas.

Baltymai yra pagrindiniai imuninės sistemos veikėjai, atpažįstantys į organizmą pakliuvusius svetimkūnius ir juos surišantys.

Gyvybės žemėje evoliucijos eigoje susiformavo labai sudėtinga automatizuota gyvybės cheminių procesų sistema, kurioje baltymai yra pagrindiniai veikėjai [2].

2.9 Baltymų panaudojimas maistui ir pramonei.

Augalai gali sintetinti aminorūgštis ir baltymus, imdami azotą iš neorganinių junginių. Gyvūnai normaliam egzistavimui turi gauti baltymus su maistu. Baltymai virškinimo procese suskaidomi į smulkiamolekulinius peptidus arba aminorūgštis, kurie įsiurbiami žarnyno ir kraujo išnešiojami po organizmą. Tai ir yra ta statybinė medžiaga, iš kurios organizmas sukuria savo kūno baltymus. Taigi baltymai maisto racione visiškai gali būti pakeisti aminorūgštimis. Kai kurias gyvybei reikalingas aminorūgštis organizmas gali pats pasigaminti iš kitų azotinių junginių, patenkančių su maistu. Yra aminorūgščių, kurių organizmas negali susintetinti ir jas reikia pateikti su baltyminiu maistu. Tokios aminorūgštys vadinamos nepakeičiamos. Joms priskiriama lizinas, triptofanas, fenilalaninas, valinas, metioninas, treoninas, leucinas, izoleucinas, histidinas, argininas.

Yra nustatyta, kad baltyminis maistas turi turėti reikalingą nepakeičiamųjų aminorūgščių kiekį. Gaunant nepakankamai nepakeičiamųjų aminorūgščių, sutrinka normali organizmo veikla.

Žmogus jam reikalingus baltymus gauna iš gyvulininkystės bei augalininkystės produktų.

Pastaruoju metu žemės ūkio gyvulių raciono maistinei vertei pakelti į pašarą pridedama labiausiai “deficitinių” aminorūgščių. Šiam tikslui organizuota stambi lizino, glutamino rūgšties ir metionino pramoninė gamyba. Lizinas sintetinamas iš kaprolaktato, t.y. iš tos pačios žaliavos, kaip ir kapronas. Į jį įvedama nitrogrupė, paskui redukuojama, kartu suardant laktamo ciklą.

Kai trūksta maiste lizino, susergama amenija, skauda galvą, padidėja jautrumas. Sintetinio lizino dedama į maistą vaikams, norint pagerinti apetitą, gydant sunkius apsinuodijimus; gyvulininkystėje jo dedama į pašarus.

Glutamino rūgštis pramonėje gaminama iš akrilo nitrilo. Ji dedama į konservus ir maisto koncentratus skoniui pagerinti.

Baltymai turi ne tik maistinę, bet ir pramoninę reikšmę. Pati stambiausia sritis, užsiimanti baltyminės žaliavos perdirbimui – odų pramonė. Baltyminės medžiagos yra natūralus šilkas ir vilna. Baltymas kazeinas, išskiriamas iš pieno, vartojamas klijams gaminti; ankščiau labai vertinama buvo plastmasė, gaunama iš kazeino (galatitas); buvo bandyta iš kazeino gauti dirbtinį pluoštą. Baltyminėms medžiagoms priskiriama želatina, vartojama kinofotomedžiagų gamyboje, taip pat maisto pramonėje [7].

2.10. Elektroforezė

Elektroforezės reiškinys pagrįstas elektrinio lauko veikiamų elektringųjų koloidinių dalelių arba polimero molekulių pernešamu elektrolito tirpale vieno ar kito elektrodo link. Nuo elektrolizės, kurios metu, tekant per tirpalą elektros srovei, ant elektrodų nusėda
ekvivalentinių kiekių elektrolizės produktai, elektroforezė skiriasi tuo, kad jos metu medžiaga pernešama tiktai viena kryptimi. Todėl elektroforezei negalioja Faradėjaus dėsnis, kuris kiekybiškai apibūdina elektrolizę. Nepaisant to, tarp šių abiejų reiškinių yra tiesioginis ryšys.

2.11. Metodo pagrindai

Koloidiniuose tirpaluose dispersinės fazės ir dispersinės terpės sąlyčio zonoje susidaro dvigubasis elektrinis sluoksnis: koloidinė dalelė įgyja tam tikro dydžio ir ženklo krūvį. Daugelis biologiniu atžvilgiu svarbių molekulių – aminorūgštys, peptidai, baltymai, nukleorūgštys, turi grupių, kurios gali jonizuotis, todėl tirpalose šie junginiai gali egzistuoti kaip katijonai arba anijonai, t. y., turėti krūvį. Be to, molekulės, turinčios panašaus dydžio krūvį, bet skirtingą masę, skiriasi viena nuo kitos ir krūvio kiekiu, tenkančiu masės vienetui. Dėl šių skirtumų elektringosios dalelės tirpale, veikiamos elektrinio lauko, yra atskiriamos. Tai ir sudaro elektroforezės pagrindą.

Dispersinės sistemos fazių judėjimą elektriniame lauke lemia dvigubojo elektrinio sluoksnio susidarymas prie tarpfazinių paviršių. Skiriamos trys tarpusavyje susijusios dvigubojo elektrinio sluoksnio susidarymo priežastys: paviršiaus funkcinių grupių disociacija, elektrolito jonų adsorbcija ir polinių molekulių orientacija tarpfazinėje riboje. Dėl tarpusavio sąveikos dalelė įgauna teigiamąjį arba neigiamąjį krūvį. Dvigubąjį elektrinį sluoksnį, t. y., savitąjį plokščiąjį kondensatorių, sudaro du lygiagretūs elektrodai. Vienas elektrodas – tai potencialą suteikiantys jonai, esantys tiesiog prie dalelės paviršiaus, antrasis – skystoje fazėje esantys priešjoniai.

Dalis priešjonių taip pat yra prie dalelės paviršiaus ir sudaro tankujį adsorbcijos sluoksnį, kuris vadinamas Helmholco sluoksniu. Kita dalis priešjonių dėl šiluminio judėjimo išplinta į skystosios fazės gilumą, sudarydami vadinamąjį difuzinį, arba Guji sluoksnį. Tariama, kad tankiojo Helmholco sluoksnio storis lygus priešjonio skersmeniui. Tolstant nuo dalelės paviršiaus, potencialas tolygiai mažėja. Pagal Guji ir Čepmeno teoriją priešjoniai dvigubojo elektrinio sluoksnio difuzinėje dalyje pasiskirsto dalelės paviršiaus potencialo lauke pagal Bolcmano pasiskirstymo dėsnį. Pagal šią teoriją potencialas difuzinėje sluoksnio dalyje, tolstant nuo paviršiaus, mažėja eksponentiškai. Difuzinio sluoksnio storis mažėja didėjant elektrolito jonų koncentracijai, jonų krūviui ir žemėjant temperatūrai.

Elektrokinetinio potencialo dydis labai priklauso nuo tirpale esancių elektrolitų. Didėjant priešjonių koncentracijai tirpale, daugiau jų per slinkimo plokštumą patenka į adsorbcinį sluoksnį: difuziniame sluoksnyje jų lieka mažiau ir šis sluoksnis plonėja. Dėl to potencialas mažėja ir jo vertė artėja prie nulio. Būsena, kai potencialas lygus nuliui, vadinama izoelektrine. Kai sistema yra izoelektrinės būsenos, dalelės suminis krūvis lygus nuliui ir elektrinis laukas dalelių neveikia, t. y., elektroforezė nevyksta. Bet tai nereiškia, kad dalelių paviršiuje nėra jonų. Potencialą suteikiančių jonų skaičius nepakinta, bet jų krūvį visiškai kompensuoja į nejudamą adsorbcinį sluoksnį patekę priešjoniai.

Amfoterinių kietųjų kūnų ir makromolekulių, turinčių įvairių jonogeninių grupių (baltymų, nukleorūgščių ir kt.), paviršiaus elektrinio potencialo dydis ir ženklas priklauso nuo tirpalo pH; izoelektrinę būseną atitinka tam tikra pH vertė. Amfoteriniams hidroksidams šią pH vertę lemia rūgštinės ir bazinės disociacijos konstantų santykis. Baltymų molekules sudarančių aminorūgščių šoninėse grandinėse yra daug įvairių rūgštinių ir bazinių grupių, taip pat –COOH ir –NH2 grupių. Šioms grupėms būdinga skirtingos disociacijos konstantos, todėl baltymo molekulės joninė būsena tirpale, esant tam tikrai pH vertei, apibūdinama sudėtinga įvairių jonogeninių grupių jonizacine pusiausvyra. Paprasčiausiu atveju izoelektrinėje būsenoje susidaro baltymo jonai H3N–R–COO¯:

R R R

H HO¯

H3N – CH – COOH H3N – CH – COO HOH3N – CH – COO

H HO¯

izoelektrinė būsena

Joninė forma: katijonas anijonas

Judėjimo kryptis: prie katodo nejuda prie anodo

Šią būseną atitinkanti tirpalo pH vertė vadinama izoelektriniu tašku. Žinoma, kada įvairių baltymų aminorūgščių sudėtis yra skirtinga, tai izoelektriniai baltymų taškai taip pat nevienodi (4.4 lentelė). Baltymo dalelių elektros krūvio ženklas nustatomas elektroforeze.

Baltymas pH

Kraujo serumo globulinas 4.5

Kazeinas 4.7

Želatina 4.7

Kiaušinio albuminas 4.8

Hemoglobinas
6.8

Histonas 8.7

1 lentelė. Izoelektrinio baltymų taško pH vertės

Be izoelektrinio taško, kuris nustatomas iš elektrokinetinių efektų, dažnai vartojama izojoninio taško sąvoka. Izojoninis taškas – tai tokia tirpalo pH vertė, esant kuriai poliamfolitas sorbuoja vienodą katijonų ir anijonų kiekį. Izojoninio taško padėčiai dažniausiai turi įtakos stipriausios rūgštinės ir bazinės grupės. Jei skystoje terpėje nėra elektrolito priedo, izojoninio ir izoelektrinio taško pH vertės sutampa. Įpylus į tokią terpę elektrolito, kurio jonai gali adsorbuotis, izoelektrinis ir izojoninis taškai pasislinks į priešingas puses nuo pH vertės, būdingos grynai skystajai terpei. Pavyzdžiui, jei makromolekulei esant izoelektrinėje (izojoninėje) būsenoje įpilsime elektrolito, kurio katijonai stipriai adsorbuojasi, makromolekulė gaus papildomą teigiamąjį krūvį. Dėl šio papildomo krūvio suirs makromolekulės rūgštinių ir bazinių grupių disociacijos pusiausvyra: iš teigiamąjį krūvį turinčios makromolekulės bus išstumiami H jonai ir padidės rūgštinių grupių disociacijos laipsnis; kartu bus pritraukiami HO¯ jonai, todėl sumažės bazinių grupių disociacija. Toks rūgštinių ir bazinių grupių disociacijos laipsnio pokytis iš dalies kompensuoja katijonų adsorbcijos metu atsiradusį teigiamąjį makromolekulės krūvį. Norint, kad makromolekulė vėl būtų izoelektrinės būsenos, būtina, keičiant tirpalo pH, padidinti HO¯ jonų koncentraciją. Adsorbuoti šie jonai visiškai kompensuos teigiamąjį krūvį, kurį makromolekulė gavo adsorbuodama katijonus iš įpilto elektrolito. Vadinasi, esant savitajai katijonų adsorbcijai, izoelektrinis taškas pasislinks į šarminę pusę. Priešingai, kad būtų pasiekta izojoninė būsena, būtina kompensuoti rūgštinių grupių disociacijos laipsnio padidėjimą dėl katijonų adsorbcijos, t. y., parūgštinti tirpalą. Analogiškai, esant savitajai anijonų adsorbcijai, izoelektrinis taškas pasislinks į rūgštinę, o izojoninis – į šarminę pusę.

Matome, kad priklausomai nuo įpilamo elektrolito kilmės jonų mainai gali turėti įtakos įvairioms dvigubojo elektrinio sluoksnio dalims: difuzinei, adsorbcinei ir net potencialą suteikiančių jonų daliai (pastaruoju atveju teisingiau būtų kalbėti ne apie jonų mainus, o apie jonų įsiskverbimą). Lengviausiai pakeičiami difuzinio sluoksnio priešjoniai.

Taip pat žinome, kad dalelių judrumui elektriniame lauke turi įtakos relaksacijos ir elektroforezinis efektai. Dėl elektrostatinių jėgų poveikio kiekviena dalelė tirpale yra apsupta priešingo krūvio jonų (vadinamosios joninės atmosferos) ir hidratinio vandens. Dalelei judant elektriniame lauke, už dalelės esanti joninė atmosfera suyra, o jos priekyje formuojasi iš naujo: suyra difuzinio sluoksnio apie dalelę sferinė simetrija. Dėl to susidaro lyg dipolis, kuris mažina elektrinio lauko efektyvųjį dydį, kartu ir dalelės judėjimo greitį bei potencialą, t. y., dalelė stabdoma. Tai vadinamasis relaksacijos efektas. Tarp relaksacijos efekto, joninės atmosferos storio ir kitų veiksnių yra sudėtinga priklausomybė. Į šį efektą galima nekreipti dėmesio tik tam tikromis sąlygomis. Elektroforezinis efektas taip pat susijęs su jonine atmosfera: dėl elektrinių jėgų priešpriešinis priešjonių srautas sukelia papildomą trintį, ir tai trukdo dalelei judėti elektriniame lauke [5].

2.12. Elektroforezės sąlygos

Elektroforeziniam dalelių judriui įtakos turi daugybė veiksnių: bandinio būsena, elektrinio lauko parametrai, buferinio tirpalo ir nešiklio charakteristikos. Bandinio būseną galima nusakyti krūviu, dalelės matmenimis ir forma. Didėjant dalelės suminiam krūviui, judrumas didėja. Krūvio dydis priklauso nuo pH. Kuo stambesnės dalelės, tuo mažesnis jų judrumas. Tas susiję su didesne trinties jėga bei stambių molekulių elektrostatine sąveika su aplinka. Vienodų matmenų, bet skirtingos formos, pavyzdžiui, fibrilinių (plaušų pavidalo) ir globulinių (kamuoliukų pavidalo) baltymų molekulių judrumas yra skirtingas. Tas taip pat siejama su trinties jėgomis ir elektrostatine sąveika.

Šiuo metu Jūs matote 51% šio straipsnio.
Matomi 5875 žodžiai iš 11548 žodžių.
Siųskite sms numeriu 1337 su tekstu INFO MEDIA (kaina 1,45 €) ir įveskite gautą kodą į laukelį žemiau:
Kodas suteikia galimybę atrakinti iki 100 straispnių svetainėje ir galioja 24 val.