ŽMOGAUS GENOLAPIAI
1996 m. biotechnologijos kompanija “Myriad Genetics” (Salt Lake City, Utah, JAV) pirmą kartą pabandė užpatentuoti BRCA1 geną. Ir tai jiems pavyko! Šiandien daugelis šalių, t. p. ir ES derasi su šia kompanija dėl leidimo tirti sergančiųjų krūties vėžiu BRCA1 geną. Ką gi padarė “Myriad Genetics”? Jos specialistai nustatė, kad BRCA1 genas yra 17-toje žmogaus chromosomoje, apytikriai ilgojo peties viduryje. Vėliau jie šią chromosomos sritį išskyrė ir klonavo. Jie aprašė BRCA1 geną, t.y. nustatė jo kontrolinės dalies ypatybes ir egzoninę / introninę sandarą. Ir pagaliau jie sekvenavo geną, t.y. nustatė jo nukleotidų seką. Kartu su daugeliu kitų mokslininkų ištyrė sergančiuosius krūties vėžiu ir identifikavo tuos geno nukleotidų sekos pakitimus, kurie lėmė ligą, t. y. nustatė dažniausias mutacijas, lemiančias moters krūties vėžį. Ir galiausiai pateikė optimalias genetinio testavimo krūties vėžiui schemas. Taigi kokie šio darbo esminiai etapai?
Pirmiausia reikia nustatyti genomo vietą, kurioje yra ieškomas genas, t. y. atlikti genetinį kartografavimą. Šis darbas nelengvas. Šiandien žinome, kad žmogaus genomą (haploidinį chromosomų rinkinį) sudaro apie 3,2 milijardo nukleotidų porų, o geno koduojančią dalį sudaro tik apie 3000 n.p. Taigi uždavinys – rasti adatą šieno kupetoje, t. y. nustatyti konkrečią geno buvimo vietą konkrečioje žmogaus chromosomoje.
GENETINIS KARTOGRAFAVIMAS
Genų kartografavimas dažniausiai pradedamas nuo krosingoverio ir genetinių mainų tarp homologinių chromosomų mejozėje padarinių statistinės analizės. Tokie tyrimai, kuriuos 1913 m. pradėjo T. Morgano mokykla, tebevyksta iki šiol. Pirmieji, nustatę dviejų žmogaus genų išsidėstymą vienas kito atžvilgiu, buvo Julia Bell ir J.B.S. Haldane. Jie nustatė, kad daltonizmo (spalvinio aklumo) genas yra žmogaus X chromosomoje už kelių genolapio vienetų nuo hemofilijos geno (Bell, Haldane, 1937). Dėl krosingoverio ir genetinių mainų susidaro rekombinantinės chromosomos ir rekombinantiniai individai (rekombinantai). Genetinės sankibos ir rekombinantinės analizės pagrindu sudaromi genetiniai genolapiai (jie skiriasi nuo fizinių genolapių).
Tarkime, kad du nealeliniai genai yra toje pačioje chromosomoje netoli vienas kito, dominantiniai tų genų aleliai (D ir E) yra vienoje homologinėje chromosomoje (paveldėtoje iš tėvo), o recesyviniai jų aleliai (d ir e) yra kitoje homologinėje chromosomoje, paveldėtoje iš motinos. Tokio asmens genotipas gali būti užrašytas taip:
D d
E e
(čia linijos žymi homologinių chromosomų porą).
Tokį genotipą galima užrašyti ir taip: DE / de. Per mejozę homologinės chromosomos atsiskiria viena nuo kitos ir patenka į skirtingas gametas. 50% tokių gametų turi DE chromosomą ir 50% – de chromosomą.
Tačiau kas atsitiks, jei tiriamieji genai chromosomoje bus vis toliau ir toliau vienas nuo kito, t.y.
D E
d e
arba
D E
d e
arba
D E ?
d e
Kuo genai chromosomoje toliau vienas nuo kito, tuo didesnė tikimybė, kad mejozėje tarp homologinių chromosomų įvys krosingoveris ir genetiniai mainai. Tokiu atveju susidarys dvi gametos su tėviniais genų rinkiniais chromosomose ir dvi gametos su rekombinantinėmis chromosomomis, t.y. D e arba d E. Taigi apskritai susidarys keturių tipų gametos:
D E ir d e, kuriose chromosomos yra kaip ir tėvų (nerekombinantinės ganetos),
D e ir d E, kuriose chromosomos yra rekombinantinės (rekombinantinės gametos).
Tradicinio genetinio kartografavimo pagrindinis principas yra tai, kad kuo toliau chromosomoje yra vienas genas nuo kito, tuo didesnė krosingoverio ir genetinių mainų tikimybė, taigi susidaro didesnė dalis rekombinantinių gametų. Ankstyvuosiuose darbuose buvo įrodyta, kad tarp rekombinacijos dažnio ir atstumo tarp genų yra tiksli priklausomybė:
X rekombinacijos % = X genolapio vienetų.
Taigi 1% rekombinacijos dažnis yra interpretuojamas kaip vienas genolapio vienetas (1 cM). 5% = 5 vnt. ir t. t.
Genai, kuriems būdingas nedidelis rekombinacijos dažnis, t. y. tarp kurių yra nedidelis atstumas, dažniausiai iš kartos į kartą perduodami kartu ir vadinami sukibusiais. Tokie genai sudaro sankibos grupę. Pagal sankibos grupes sudarytas genolapis vadinamas sankibos genolapiu. Pačia didžiausia sankibos grupe galima laikyti visą chromosomą su daugeliu genų.
Krosingoverį, vykstantį tarp homologinių chromosomų (1 pav.), galima pamatyti per mikroskopą. Nors žmogaus ir kitų žinduolių chromosomose susidariusių chiazmų beveik neįmanoma įžvelgti, augalų, vabzdžių ir amfibijų ląstelėse šį procesą nesunku stebėti.
1 pav. Krosingoverio, vykstančio mejozės I profazėje, schema. Čia homologinės X chromosomos parodytos viena šalia kitos, nors iš tikrųjų jos yra viena prieš kitą ir sudaro bivalentą (žr. chromosomų poros skerspjūvį viršuje)
Imkime tuos pačius genus, kuriuos tyrė ir X chromosomoje lokalizavo J. Bell ir J.B.S. Haldane (1 pav.). Čia pažymėtos dvi alelinių genų poros:
G ir g (normalus ir sutrikusį spalvinį matymą lemiantys genai)
H ir h (normalus ir hemofiliją lemiantis genai).
Paveiksle matyti, kad genetiniuose mainuose dalyvauja tik po vieną neseserinę chromatidę iš abiejų homologinių X chromosomų. Galiausiai susiformuoja keturios moteriškos lytinės ląstelės. Dvi iš jų turi
tas pačias motinines chromosomas ir dvi – jau su naujais genų alelių rinkiniais, susidariusiais po genetinių mainų tarp homologinių chromosomų neseserinių chromatidžių:
g h g H G h G H .
mot rek rek mot
Vis dėlto kokie yra svarbiausi reikalavimai, norint nustatyti atstumą tarp genų?
1. Abu tėvai pagal abu tiriamuosius genus turi būti heterozigotiniai. Kitaip nepavyks nustatyti, kurie asmenys yra rekombinantiniai, o kurie ne. Heterozigotinių tėvų palikuonių genotipai gali būti dvejopi:
g G arba g G.
h H H h
nerekomb. vaikai rekomb. Vaikai
Norint teisingai įvertinti rekombinacijos dažnį, reikia žinoti fazę, t. y. kurioje chromosomoje yra konkretus geno alelis. Tik tada bus galima tiksliai nustatyti rekombinantinius palikuonis.
2. Genetikai dažniausiai bando nustatyti tik nedideliu atstumu (dažniausiai mažiau kaip 20 genolapio vienetų (cM)) vienas nuo kito išsidėsčiusius genus. Taip daroma todėl, kad tarp toliau esančių genų gali susidaryti kelios chiazmos, ir tada rekombinacijos dažnis bus įvertintas neteisingai.
3. Maksimalus rekombinacijos dažnis yra 50%. Net jei susidarytų kelios chiazmos tarp vienas nuo kito nutolusių genų, rekombinacijos dažnis nebūtų didesnis kaip 50%. Maksimalų 50% rekombinacijos dažnį nulemia tai, kad iš keturių chromatidžių tik dvi, sudarančios bivalentą mejozėje (t. y. 50%), dalyvauja genetiniuose mainuose. Svarbu pažymėti, kad tarp dviejų genų, esančių nehomologinėse chromosomose, rekombinacijos dažnis taip pat lygus 50%. Tai lemia G. Mendelio nepriklausomo genų paveldėjimo dėsnis (gametų tipai: ¼ DE; ¼ De; ¼ dE; ¼ de). Dvi iš jų (t. y. 50%) visuomet rekombinantinės, o kitos dvi (50%) – tėvinės. Taigi iš principo nepriklausomai nuo to, ar genai yra labai toli vienas nuo kito homologinėse chromosomose, ar yra nehomologinėse chromosomose, rekombinacijos dažnis bus lygus 50%.
Pasirinkę kartografavimui du nepriklausomus genus, turime:
1) rasti šeimas, kuriose abu tėvai būtų heterozigotiniai pagal tiriamus genus;
2) turime žinoti genų fazę chromosomose ir nustatyti, kaip genai ir chromosomos buvo paveldėti šeimoje;
3) tiriami genai turi būti tokiu atstumu (< 20 cM), kurį galėtume įvertinti. Kadangi iš anksto nežinome, kaip toli vienas nuo kito jie yra, tai dažniausiai sankiba ir nenustatoma. Apskritai, bendras žmogaus chromosomų genetinis ilgis sudaro apie 3700 genolapio vienetų (cM), todėl aptikti sankibą < 20 cM nėra lengva.
Dar daugiau, dviejų genų kartografavimui reikalinga ne viena, o daugelis šeimų, pagal kurias būtų galima statistiškai patikimai įvertinti rekombinantų dalį, ir kurios patenkintų tyrimo reikalavimus.
Iš pradžių buvo tiriami ligų genų atstumai nuo genų, lemiančių kraujo grupes. Pastariesiems būdingas didelis polimorfizmas, todėl ir heterozigotinius asmenis buvo lengviau rasti. Tačiau kraujo grupių skaičius ribotas, todėl jas lemiančių genų kaimynystėje gali būti tik ribotas kitų genų skaičius. Tokie genų sankibos tyrimai buvo išsemti jau apie 1970 metus
Naujas žingsnis kartogrfuojant genus buvo DNR žymenų atradimas apie 1980 metus. DNR žymenys – tai tam tikros nukleotidų sekos konkrečioje genomo vietoje, kurias galima nustatyti molekuliniais metodais. Vieni iš tokių žymenų grupių yra variabilus tandeminių pasikartojimų skaičius arba VTPS (angl. variable number of tandem repeats, VNTR). Tai dažniausiai 15–35 nukleotidų ilgio daug kartų paeiliui pasikartojančios nukleotidų sekos, pvz., 16 nukleotidų seka AGAGGTGGGCAGGTGG, esanti kiekvieno iš mūsų genome ir būtent nekoduojančiose genomo dalyse. Ji gali pasikartoti keliolika kartų. Pasikartojimų skaičius yra griežtai paveldimas, todėl kiekvieną asmenį galima charakterizuoti pagal jo VTPS, t. y. užrašyti jo genotipą, pvz., 16//14.
Kita DNR žymenų grupė yra trumpi tandeminiai pasikartojimai arba TTP (angl. short tandem repeats, STR). Tai trumpos (dažniausiai 2–5 nukleotidų) sekos, paeiliui pasikartojančios 20–30 kartų. Pagal jas taip galima užrašyti konkretaus asmens genotipą, pvz., 21//22.
Pirmieji DNR žymenys buvo restrikcijos fragmentų ilgio polimorfizmai arba RFIP (angl. restriction fragment length polymorphism, RFLP). Šį polimorfizmo tipą nulemia vieno nukleotido pakaitos restrikcijos endonukleazės (restriktazės) atpažinimo vietoje. Jei restriktazė randa savo atpažinimo vietą (t. y. tam tikrą nukleotidų seką), ji kerpa DNR grandinę. Jei toje vietoje yra įvykusi mutacija ir pakeistas bent vienas nukleotidas, pakinta restriktazės atpažinimo vieta, ir ši nebekerpa DNR grandinės. Kiekvieno asmens genotipas gali būti įvertintas pagal konkrečios restriktazės konkrečios kirpimo vietos buvimą (+) arba nebuvimą (-), t. y. +//+, +//-, -/-.
Dar vienas neseniai atrastas DNR polimorfizmo tipas yra vieno nukleotido polimorfizmas arba VNP (angl. single nucleotide polymorphism, SNP). Šis polimorfizmas žmogaus genome labai dažnas. Pagal jį taip pat galima genotipiškai įvertinti konkretų asmenį konkrečioje genomo vietoje, t. y. jį pažymėti kaip + arba – pagal konkretų nukleotidą. VNP, kaip ir kitus DNR polimorfizmus, lemia mutacinis procesas, tik šiuo atveju turime įvairias nukleotidų pakaitas. Žmogaus genome nustatytos daugelio VNP, RFIP, TTP, VTPS vietos, ir šiuos DNR žymenis galima panaudoti kaip konkrečius požymius
žymenis) kartografuojant genus. Belieka surasti šeimas, kuriose tėvai būtų heterozigotiniai pagal analizuojamus požymius, kad būtų galima įvertinti rekombinacijos pastarųjų atžvilgiu dažnį (2 pav.).
2 pav. Nerekombinantiniai (NR) ir rekombinantiniai (R) individai nealelinių A ir B žymenų atžvilgiu trijų kartų genealogijoje. A1, A2 – A žymens aleliai; B1 ir B2 –B žymens aleliai. Pilkai pažymėtas alelių derinys, kurio kilmę (iš tėvo II1 paveldėta chromosoma) galima nustatyti
Sudarant šiuolaikinius žmogaus genolapius naudojamos referentinės CEPH šeimos. Tai didelės ir turinčios plačias genealogijas mormonų šeimos, gyvenančios JAV Jutos valstijoje. Kiekvieną CEPH šeimą sudaro trys kartos: keturi seneliai, du tėvai ir ne mažiau kaip šeši vaikai. Tokioje šeimoje galima tiksliai nustatyti DNR žymenų fazę, nustatyti, kaip genai, esantys konkrečioje chromosomoje, buvo perduoti per kartas, ir, galiausiai, kurie asmenys konkrečių žymenų poros atžvilgiu yra rekombinantai, o kurie – ne. CEPH šeimų narių ląstelės buvo imortalizuotos, t. y. sukurtos permanentinės ląstelių linijos, palaikomos Žmogaus polimorfizmo tyrimų centre Paryžiuje. Šios ląstelių linijos šiandien naudojamos kaip referentinė medžiaga, pagal kurią galima pasitikrinti gautus rezultatus.